細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率低的幾大因素

細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率低是因?yàn)檫@個

影響轉(zhuǎn)染試驗(yàn)的因素：

1轉(zhuǎn)染試劑跟細(xì)胞系不匹配

轉(zhuǎn)染試劑跟細(xì)胞系也是講究配合默契的，使用同一種試劑，不同細(xì)胞系轉(zhuǎn)染效率通常不同。但細(xì)胞系的選擇通常是根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需要，因此在

轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)前應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求和細(xì)胞特性選擇適合的轉(zhuǎn)染試劑。每種轉(zhuǎn)染試劑都會提供一些已經(jīng)成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株列表和文獻(xiàn)，通過這些資料

可選擇適合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的轉(zhuǎn)染試劑。當(dāng)然，適合的是高效、低毒、方便、廉價(jià)的轉(zhuǎn)染試劑。

2細(xì)胞狀態(tài)變化

因?yàn)橛行┘?xì)胞系是不穩(wěn)定的，可能隨著培養(yǎng)時間的改變，培養(yǎng)條件的不同，不同的選擇壓力，可能引起不同的克隆選擇。因此就算是同一個細(xì)胞系，在不同條件下轉(zhuǎn)染能力的差異可能會

很大

（1）轉(zhuǎn)染試劑與細(xì)胞不匹配

細(xì)胞轉(zhuǎn)染適合的不是原代細(xì)胞，也不是傳代很多次的細(xì)胞。這是因?yàn)榧?xì)胞培養(yǎng)在實(shí)驗(yàn)室中保存數(shù)月和數(shù)年后會經(jīng)歷突變，總?cè)旧w重組或

基因調(diào)控變化等而演化。這會導(dǎo)致和轉(zhuǎn)染相關(guān)的細(xì)胞行為的變化。適合轉(zhuǎn)染的細(xì)胞是經(jīng)過幾次傳代后達(dá)到對數(shù)生長期的細(xì)胞，細(xì)胞生長旺盛

，最容易轉(zhuǎn)染。

（2）把握時機(jī)

沒錯！轉(zhuǎn)染也有適當(dāng)?shù)臅r機(jī)，相比較非分裂細(xì)胞——分裂細(xì)胞往往要比靜止細(xì)胞更易于攝取并表達(dá)外源DNA。因此對大多數(shù)轉(zhuǎn)染操作而言，細(xì)胞都在轉(zhuǎn)染當(dāng)天或前一天種板。

同樣重要的是細(xì)胞在種板進(jìn)行轉(zhuǎn)染時不應(yīng)處于過度生長的狀態(tài)，如癌細(xì)胞數(shù)量過多，互相疊加，營養(yǎng)物質(zhì)耗竭，代謝廢物積聚，轉(zhuǎn)染率低下也是很正常的！

因此，一定要在最適細(xì)胞密度時轉(zhuǎn)染，才能獲得較高的轉(zhuǎn)染率。不同的轉(zhuǎn)染試劑，要求轉(zhuǎn)染時的最適細(xì)胞密度各不相同，即使同一種試劑，也會因不同的細(xì)胞類型或應(yīng)用而異。

（3）微生物來搗亂

培養(yǎng)物可被細(xì)菌、酵母、真菌、病毒、支原體、甚至其他細(xì)胞種類所污染。各種污染都會導(dǎo)致產(chǎn)生錯誤的結(jié)果。

（4）交叉污染

如果同一個實(shí)驗(yàn)室同時培養(yǎng)不同種類的細(xì)胞，很同意發(fā)生“細(xì)胞串門"的現(xiàn)象，造成交叉污染。

3轉(zhuǎn)染方法

不同轉(zhuǎn)染試劑有不同的轉(zhuǎn)染方法，但大多大同小異。轉(zhuǎn)染時應(yīng)跟據(jù)具體轉(zhuǎn)染試劑推薦的方法，但也要注意，因不同實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的細(xì)胞性質(zhì)不同

，質(zhì)粒定量差異，操作手法上的差異等，其轉(zhuǎn)染效果可能不同，應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)室的具體條件來確定最佳轉(zhuǎn)染條件。

（1）血清

轉(zhuǎn)染后未及時加入血清，會導(dǎo)致細(xì)胞大量死亡。一般要在轉(zhuǎn)染后的4-6小時換液且換為有血清的培養(yǎng)基。也可以在原來的無血清培養(yǎng)基里面滴

加血清。這個時候，最好不要換液，不要打擾細(xì)胞，讓它安安靜靜地休息。但是也不能過早加入血清。過早的話，會引起未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞生

長。那么，什么是最佳時機(jī)呢？在20%的細(xì)胞變圓的時候，就是加血清的最佳時機(jī)。

不過要特別注意：血清是一種包含生長因子及其它輔助因子的不確切成分的添加物，對不同細(xì)胞的生長作用有很大的差別。血清質(zhì)量的變化

直接影響細(xì)胞生長，因此也會影響轉(zhuǎn)染效率。新加培養(yǎng)基的預(yù)熱對細(xì)胞轉(zhuǎn)染很有幫助。

（2）DNA質(zhì)量

DNA質(zhì)量對轉(zhuǎn)染效率影響非常大。一般的轉(zhuǎn)染技術(shù)（如脂質(zhì)體等）基于電荷吸引原理，如果DNA不純，如帶少量的鹽離子，蛋白，代謝物污染都會顯著影響轉(zhuǎn)染復(fù)合物的有效形成及轉(zhuǎn)染的進(jìn)行。

4載體構(gòu)建

轉(zhuǎn)染載體的構(gòu)建（病毒載體，質(zhì)粒DNA，RNA，PCR產(chǎn)物，寡核苷酸等）也影響轉(zhuǎn)染結(jié)果。因此選擇組成或可調(diào)控，強(qiáng)度合適的啟動子也很

重要，同時做空載體及其它基因的相同載體構(gòu)建的轉(zhuǎn)染正對照可排除毒性影響的干擾。

所以轉(zhuǎn)染用的質(zhì)粒首先要保證數(shù)量，一般為2 μg以上。質(zhì)粒純度不夠或者含有細(xì)菌LPS或其他對細(xì)胞有毒害作用的物質(zhì)，也會影響轉(zhuǎn)染效率。

這個時候，就應(yīng)該對質(zhì)粒進(jìn)行純化和濃縮。